结核分枝杆菌膜囊泡的分离及其对细胞因子释放的作用

摘要：目的 分离体外培养的结核分枝杆菌分泌的膜囊泡,检测其形态和粒径分布,初步探索结核分枝杆菌膜囊泡对巨噬细胞中细胞因子释放的作用.方法 采用结核分枝杆菌实验室标准菌株H37Rv,通过7H9培养基复苏、扩大培养标准株H37Rv至对数生长期,菌体全部接种于苏通培养基中继续培养3周,离心取上清,超滤浓缩结合超速离心分离提取结核分枝杆菌H37Rv膜囊泡,通过透射电镜观察膜囊泡的大小、形态,采用纳米颗粒跟踪仪分析膜囊泡的粒径及分布.同时,设置不处理对照组、H37Rv感染组[按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)=20∶1]和H37Rv膜囊泡处理组(按照膜囊泡∶细胞=100∶1)处理佛波酯(50 ng/ml)诱导贴壁的单核巨噬细胞(THP-1)4 h,更换新鲜培养基后0 h、4 h、8 h、24 h收集细胞培养上清,采用Milliplex多细胞因子检测试剂盒检测细胞因子的释放情况,通过曼-惠特尼U(Mann-Whitney U)检验对各时间点H37Rv膜囊泡处理组和不处理对照组之间肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素10(IL-10)释放量进行比较,以P<0.05为差异有统计学意义. 结果 按照调整后的提取方法得到的提取物中可检测到H37Rv分泌的膜囊泡,平均粒径为137 nm,主要分布在30~510 nm之间,<250 nm的膜囊泡数量占总量的96.88%.4 h、8 h和24 h 的TNF-α、IL-6和IL-1β释放量与不处理对照组[分别为348.19(333.99,360.47) pg/ml、412.38(406.67,418.79) pg/ml、324.44(316.11,331.14) pg/ml;3.01(2.81,3.02) pg/ml、5.40(5.26,5.83) pg/ml、13.22(11.80,13.77) pg/ml;118.92(113.97,122.47) pg/ml、132.33(125.87,137.62) pg/ml、169.31(167.75,172.49) pg/ml]相比,H37Rv膜囊泡处理组[分别为507.33(501.80,513.84) pg/ml、4483.00(4130.75,4522.50) pg/ml、8170.00(8058.25,8206.75) pg/ml;12.88(12.04,13.84) pg/ml、68.51(66.88,69.77) pg/ml、335.44(331.02,340.64) pg/ml;800.57(791.18,809.60) pg/ml、1559.00(1546.00,1566.00) pg/ml、4316.50(4094.75,4389.75) pg/ml]均明显增加,差异均有统计学意义(U值均<0.001,P值均<0.01);但4 h、8 h和24 h的IL-10释放量[不处理对照组分别为1.23(1.21,1.31) pg/ml、1.56(1.31,1.82) pg/ml、5.41(4.99,5.89) pg/ml;H37Rv膜囊泡处理组分别为4.56(4.49,4.82) pg/ml、1.43(1.28,1.89) pg/ml、1.56(1.48,1.68) pg/ml]差异均无统计学意义(U值分别为6.00、17.00、7.00,P值分别为0.065、0.898和0.087). 结论 本研究建立了结核分枝杆菌膜囊泡分离提取的技术流程,可以得到纯度较好、形态完整、粒径正常的膜囊泡.同时,结核分枝杆菌膜囊泡可以诱发巨噬细胞中细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放.